Cultivo y antibiograma en infecciones osteoarticulares y heridas

Interpreta y emplea informe

El diagnóstico de las infecciones osteoarticulares se realiza a través de la clínica, laboratorio, histopatología, microbiología e imagenología. El estudio de líquido sinovial y cultivos intraoperatorios son las muestras más precisas para determinar el agente causante de una infección osteoarticular.

La obtención de una muestra de calidad es el paso inicial del que va a depender la calidad de los resultados microbiológicos que se obtengan. La toma y manipulación de las muestras se debe realizar siguiendo las recomendaciones estándar internacionales. La manipulación de este tipo de muestras en el laboratorio implica el cumplimiento de las normas generales de calidad que se emplean para el manejo de muestras ordinariamente estériles.

Generalidades en la obtención, transporte y conservación de las muestras

– Se debe evitar la recogida de muestras de líquido articular y exudados periimplante con tórulas.

– En general, todas las muestras se deberían tomar antes del inicio del tratamiento antibiótico y si este ha comenzado se debería interrumpir (si es posible) 2 días antes de la toma de muestras, y en el caso de las infecciones peri- implantes hasta 15 días antes.

Cuando las muestras se tomen durante una intervención quirúrgica que requiera profilaxis antibiótica, la profilaxis se debe posponer, en la medida de lo posible, hasta que se hayan tomado las muestras para cultivo.

– Las muestras se deben obtener en las mayores condiciones de asepsia posible, realizando una correcta desinfección de la piel y manipulándolas lo menos posible.

– Las muestras líquidas se deben inocular en un medio de transporte adecuado, como recipientes con medio de transporte de anaerobios (tipo portagerm o similar) o frascos de hemocultivos en el caso de líquidos claros, siempre conservando una alícuota para la tinción de Gram. En el caso de muestras escasas se podrán enviar en la propia jeringa, con el aire extraído, sin aguja y convenientemente tapadas con tapón estéril.

– Las muestras de biopsias se deben enviar sumergidas en suero salino para evitar la desecación. El envío de las muestras al laboratorio debe ser inmediato. Su procesamiento se debe realizar lo antes posible y si se tiene que retrasar (máximo 24h) las muestras se deben conservar refrigeradas entre 2–8°C. En el caso de sospecha de infección por N. gonorrhoeae, las muestras se deben inocular inmediatamente en medios selectivos. Las muestras en medio de transporte de anaerobios se deben mantener a temperatura ambiente. En ningún caso se pueden congelar las muestras destinadas al cultivo.

1. Líquido articular: se explica técnica y diagnóstico en capítulo “Gram en líquido articular y citoquímico de líquido articular”

2. Cultivo de tejido e implantes:

– Se recomiendan realizar toma de cultivo de al menos tres áreas. En lo posible, se debería hacer la toma de cultivo sin terapia antiomicrobiana las 2 semanas previas. Esto considera también la profilaxis perioperatoria, la cual debe realizarse después de la toma de cultivo.

– Es fundamental evitar la contaminación de las muestras con microorganismos de la piel. Muchos de los microorganismos de la piel pueden ser causa de este tipo de infecciones, sobre todo si están asociadas a implantes.

– La tinción de Gram es por el momento el único método microbiológico de diagnóstico rápido, pero tiene muy baja sensibilidad, aunque gran especificidad.

– Los resultados de los cultivos de los exudados de fístulas no representan la realidad de lo que ocurre en el interior del hueso, sólo han demostrado tener cierto valor en las osteomielitis causadas por S. aureus. En caso de utilizarse, se deben obtener las muestras mediante la aspiración con aguja y evitar el uso de tórulas. Los resultados de los cultivos de fístulas deben interpretarse con precaución.

– Los implantes retirados se deben enviar para cultivo en caso de sospecha de infección. La ventaja de cultivar los implantes radica en que se analiza directamente del lugar de la infección. Los últimos trabajos publicados han demostrado la utilidad de la sonicación y posterior siembra del sonicado para aumentar el rendimiento de los cultivos al liberar el biofilm que recubre el implante (sensibilidad 75%, especificidad 87%). El principal inconveniente de este método es su laboriosidad y la facilidad de contaminación, que muchas veces está causada por el manejo de los implantes. Se recomienda asociarlo con la toma de cultivo del tejido periprotésico, cuya técnica es más sencilla y mejora la especificidad (sensibilidad 54% y especificidad 98%)

– La interpretación de los resultados de los cultivos debe ser cuidadosa y realizarse considerando los resultados obtenidos para el resto de las muestras del mismo paciente.

3. Hemocultivos: sólo un bajo porcentaje de las infecciones osteoarticulares son bacterémicas (excepto en las osteomielitis hematógenas), por tanto, la utilidad del hemocultivo es limitada, aunque lógicamente se sigue recomendando su empleo.

Medios de cultivo y condiciones de incubación

La inoculación directa de las muestras de líquido sinovial, homogenizados de biopsias y exudados debe realizarse en medios sólidos convencionales para bacterias aerobias (agar sangre, agar chocolate), anaerobias (agar Brucella o agar Schaedler) y medios selectivos para aislamiento de bacilos Gram negativos (agar McConkey o similar). Si se considera necesario y hay muestra suficiente se sembrarán también medios selectivos para estreptococos (CNA agar sangre-colistina- nalidixico. Además, se inoculará un medio caldo de enriquecimiento tipo BHI (brain-heart-infusion), TSB (tryptone-soya-broth) o tioglicolato.

Las botellas de hemocultivos inoculadas con líquidos articulares se introducirán en el sistema automatizado que disponga cada laboratorio.

Para el cultivo de N. gonorroheae se inoculará además una placa de medio Thayer-Martin y se incubará en atmósfera con 5% de CO2.

Las temperaturas y atmósferas de incubación serán las convencionales para cada tipo de medio de cultivo.

El tiempo de incubación de las placas será de 2–7 días y el de las botellas de hemocultivo y los caldos de enriquecimiento de 7–10 días. En caso de sospecha de microorganismos de crecimiento lento, este período se alargará convenientemente.

Precauciones e interpretación de resultados

Dado que todas las muestras que se procesan para el diagnóstico de las infecciones osteoarticulares proceden de sitios habitualmente estériles, se debe dar valor a cualquier microorganismo que se visualice en la tinción de Gram. Se debe visualizar la extensión completa ya que en este tipo de infecciones los microorganismos suelen estar en cantidades bajas. Si se visualizan microorganismos que se considera que no pueden crecer en los medios habituales se añadirán los medios de cultivo adecuados para su crecimiento. Se valorará la presencia de leucocitos polimorfonucleares que indican la presencia de reacción inflamatoria.

Se comprobará diariamente el crecimiento de microorganismos tanto en los medios sólidos como líquidos. Si se observa crecimiento en los medios sólidos se intentará realizar una identificación presuntiva del microorganismo aislado mediante tinción de Gram, catalasa, staphslide, etc., y si se considera relevante se avisará al clínico del hallazgo. En infecciones osteoarticulares es muy importante una evaluación minuciosa de los cultivos, buscando diferentes morfotipos, sobre todo en el caso del aislamiento de posibles contaminantes de la piel (S. epidermidis, estafilococos coagulasa negativa, etc.). Se procurará realizar una interpretación conjunta de todas las muestras del mismo paciente. Si se obtienen cultivos mixtos se realizarán los subcultivos necesarios para obtener los microorganismos en cultivo puro. Si no hay crecimiento se reincubarán todas las placas.

En muestras de pacientes portadores de implantes se deben valorar como significativos los aislados de microorganismos que en otras circunstancias se considerarían como microbiota normal de la piel (S. epidermidis, estafilococos coagulasa negativa, Corynebacterium spp., P. acnes, Streptococcus del grupo viridans, etc.). En otro tipo de muestras se deben considerar como causantes de la infección si se aíslan en cultivo puro. La interpretación de su papel en la infección dependerá en gran medida de los resultados de otras muestras del mismo paciente.

Tanto si hay crecimiento en las placas de cultivo primario como si no hay crecimiento y el caldo está turbio, se realizará tinción de Gram y según los microorganismos que se observen se realizarán subcultivos en los medios generales y selectivos adecuados para su aislamiento. Cuando las muestras se han inoculado sólo en caldos de enriquecimiento, es conveniente realizar al final del periodo de incubación un pase “de salida” a medios sólidos, aunque no se haya observado turbidez. En la valoración de los cultivos negativos se debe tener en cuenta la posibilidad de que el paciente haya recibido tratamiento antibiótico previo a la obtención de la muestra.

Se identificarán todos los aislados y se realizarán las pruebas de sensibilidad a los antibióticos según los medios disponibles en cada laboratorio. Si se registra aparentemente crecimiento del mismo microorganismo en distintas muestras del mismo paciente se realizará la identificación y pruebas de sensibilidad a todos ellos, para facilitar la interpretación del papel de los microorganismos aislados en la infección, especialmente en muestras de pacientes portadores de prótesis articulares. En los microorganismos anaerobios no suele estar recomendada la realización de pruebas de sensibilidad a todos los aislados.

Los cultivos de los implantes se deben interpretar de forma cuantitativa.

Se recomienda guardar las placas de la siembra directa hasta que se tengan los resultados definitivos del cultivo, por si fuera necesario realizar pruebas adicionales.

Se informarán todos los microorganismos presentes en la tinción de Gram, siempre que las muestras hayan sido recogidas y conservadas convenientemente. La presencia de leucocitos polimorfonucleares se podrá informar como escasa, moderada o abundante (no se realizan tinciones cuantitativas).

Cualquier información sobre los cultivos que pueda tener significado clínico y pueda reconducir la actitud terapéutica debe ser notificada con la mayor rapidez posible al clínico responsable del paciente.

Antes de emitir los informes de resultados se tratará de evaluar de forma conjunta los resultados de todas las muestras de un mismo paciente, sobre todo en caso de sospecha de infecciones peri-implantes. Se tendrán en cuenta los resultados de la tinción de Gram y su concordancia con los resultados de los cultivos. Se considerará si el mismo microorganismo (biotipo y antibiotipo) está en más de una muestra. En el informe de resultados deberán constar todos los microorganismos aislados y la sensibilidad a los grupos de antibióticos que determine cada laboratorio.

Los aislados pertenecientes a la microbiota normal de la piel (Corynebacterium, estafilococos coagulasa negativa, etc.) se informarán como flora de contaminación cutánea en el caso de muestras de pacientes con artritis séptica y osteomielitis. En el caso de infecciones asociadas a implantes se informarán siempre con su sensibilidad a los antibióticos y se destacará si su aislamiento se ha realizado solamente en el caldo de enriquecimiento y si se han aislado únicamente tras cultivo prolongado.

Observaciones y procedimientos no aceptables

El laboratorio debe ser estricto en la valoración microbiológica de los aislados que pueden formar parte de la microbiota de la piel o ser contaminantes y con el modo en que se emite la información de los resultados de los cultivos. De un modo muy general, un informe con el aislamiento e identificación y determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos de uno o más microorganismos se suele interpretar como diagnóstico de infección, lo que puede provocar que se administre tratamiento antimicrobiano innecesariamente. Se debe tener especial cautela con los resultados de los cultivos de los implantes.

Si sólo se remiten botellas de hemocultivos inoculadas con líquido articular no se podrá realizar la tinción de Gram. La interpretación de los resultados de los cultivos de muestras de biopsias periprotésicas es difícil si no se envían al menos 3 muestras. Se desaconseja rotundamente la toma de líquido articular y exudados periprotésicos con tórulas (mayor contaminación, volumen insuficiente de muestra para los cultivos, inhibición de ciertos patógenos y menor supervivencia de las bacterias). No está indicado el procesamiento de muestras obtenidas a través de tubos de drenaje colocados durante más de 2 días, por la gran probabilidad de contaminación con la microbiota de la piel. No se deben procesar las muestras remitidas con conservantes tipo formol.

Interpretación de los estudios de susceptibilidad antimicrobiana

Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos , bajo condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas. La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clínico algunas recomendaciones sobre la terapia que puede ser más apropiada en pacientes con una infección específica. No obstante, la correlación exacta entre los resultados in vitro y la respuesta clínica es muchas veces difícil de predecir, ya que existen numerosos factores (Tabla 1) que influencian la interacción de agentes antimicrobianos y microorganismos en un determinado paciente. La metodología usada para realizar el estudio de susceptibilidad toma en consideración algunos de estos factores para determinar más eficientemente cómo un microorganismo podría responder in vivo a un determinado antibiótico.

Factores que influyen en la correlación entre los resultados del antibiograma y la respuesta clínica

Factores que influyen en la respuesta al tratamiento antibiótico

Existen factores propios del agente antimicrobiano, como son absorción, distribución, metabolismo, eliminación, unión a proteínas plasmáticas y otros parámetros farmacocinéticos los cuales pueden influenciar la respuesta del paciente.

La concentración del antibiótico en el sitio de la infección es otro factor importante a considerar en la elección de un antibiótico.

Por ejemplo, cefalotina no cruza la barrera hematoencefálica, por lo que una meningistis causada por E.coli susceptible a cefalotina in vitro, no responderá a una terapia con este antibiótico. En cambio, una infección urinaria causada por una cepa de . coli resistente a cefalotina podría responder bien, ya que este antibiótico es concentrado en la orina.

Además de la propia virulencia del germen, el número de organismos presentes en el sitio de la infección («efecto del inóculo») puede ser un factor muy importante. La concentración de organismos usados para el estudio de susceptibilidad en el laboratorio ha sido estandarizado en 5 x 105 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml. Un aumento en el número de organismos en el sitio de infección puede variar significativamente la respuesta de un antibiótico, por lo que pueden ser necesarias concentraciones mayores de éste para inhibirlo.

Por último, y quizás los más importantes, son los factores propios del huésped. En un paciente inmunocomprometido, el efecto de la infección, unido a su enfermedad de base, puede resultar en falla de la terapia aunque el germen sea susceptible al antibiótico usado. Además, pacientes hospitalizados por largo tiempo tienen un riesgo más alto de contraer una infección sobreimpuesta a la infección original, la que puede ser causada por gérmenes generalmente más resistentes. En estos pacientes, por lo tanto,es necesario evaluar nuevamente el germen causal y repetir el estudio de susceptibilidad.

Para que exista una buena correlación entre los resultados de laboratorio y la respuesta clínica, es muy importante obtener una muestra que sea representativa del proceso infeccioso, por ejemplo si el organismo aislado es un contaminante del sitio de la infección en vez del organismo causal, la respuesta clínica puede ser independiente de los resultados obtenidos in vitro. Por lo tanto, es de extrema importancia una apropiada y cuidadosa obtención de la muestra, especialmente si la infección se encuentra en un área normalmente colonizada por bacterias, ya que en estos casos la interpretación del cultivo bacteriológico es más difícil.

Hasta ahora hemos revisado varios de los factores que pueden influenciar la respuesta clínica a un tratamiento antibiótico para una determinada infección. Si consideramos estas variables, el estudio de susceptibilidad antimicrobiana sigue siendo una ayuda importante en la elección de una apropiada terapia antimicrobiana. Se puede predecir una buena respuesta al tratamiento si sabemos que el germen es susceptible al antibiótico indicado y una falla terapéutica puede ser esperada si el germen es resistente.

Indicaciones para el estudio de suceptibilidad antimicrobiana

Debido a que los microorganismos tienen susceptibilidad variable a los agentes antimicrobianos, es necesario tener una herramienta que permita determinar la susceptibilidad del microorganismo causante de la infección.

Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por lo que debemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayoría de los microorganismos aislados. Hasta hace unos años atrás, los laboratorios de microbiología o realizaban estudios de susceptibilidad en S. pneumoniae o S. pyogenes porque se consideraban generalmente susceptibles a los antibióticos usados para tratar infecciones causadas por estos organismos.

Desafortunadamente, al igual que en el resto del mundo, en nuestro país han sido aisladas cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina y S. pyogenes resistentes a eritromicina.

La indicación primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el antibiótico más apropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso infecciosos. En la mayoría de los casos, cuando el paciente comienza su enfermedad se indica un antibiótico de amplio espectro (o una combinación de antibióticos) hasta obtener resultados acerca de la identificación del germen causal de la infección. Posteriormente, cuando los resultados del antibiograma están disponibles, puede indicarse un antibiótico más específico.

Métodos de estudio de susceptibilidad antimicrobiana

*!Abreviaciones: S, susceptible; I, Intermedio; R, resistente **CIM, concentración inhibitoria mínima

Difusión en agar:
Este método, que es el más frecuentemente usado, es también llamado difusión por disco o Kirby-Bauer, En este caso, el microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico.. Las placas se incuban por 16-18 horas a 35oC. Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco.

En un punto determinado, la concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio.El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías de susceptible, intermedio o resistente (S,I, o R) de acuerdo a las tablas publicadas por el National Committee for Clinical Laboratories Standards. Si las recomendaciones para realizar este método son fielmente seguidas, las categorías se correlacionan muy bien con los resultados de los otros métodos.

Dilución en agar:
Es considerado el método de referencia . En este método, placas conteniendo una determinada concentración de un antibiótico son inoculadas con el microorganismo en estudio y luego incubadas por 16 a 18 horas. Después de la incubación, se examina si el organismo crece o no en cada una de las placas, con lo cual se determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) para el antibiótico. Si una cepa de S. aureus crece en una placa que contiene una concentración de oxalina de 0,06 ug/ml pero no crece en una placa con una concentración de oxalina 0,12 ug/ml, significa que la CIM de oxalina que se requiere para inhibir a ese organismo es 0,12 ug/ml.

Dilución en caldo:
En este caso, tubos (macrodilución) o microplacas (microdilució) contienen concentraciones crecientes de un determinado antibiótico. El organismo en estudio es inoculado en los diferentes tubos o pocillos de la microplaca y la CIM es determinada después de la incubación, de la misma forma descrita anteriormente para el método de la dilución en agar.

E-test:
Este método ha sido descrito más recientemente y representa una sofisticada combinación de los métodos descritos anteriormente. El E-test es más simple que otros métodos para obtener una CIM. Utiliza una tira de plástico que contiene concentraciones crecientes de un determinado antibiótico que van desde 0,016 ug/ml hasta 256 ug/ml/ Esta tira se pone sobre una placa de agar que ha sido inoculada con el organismo en estudio. Después de incubar la placa por 16 a 18 horas, se forma un área de inhibición de forma elíptica, en la cual la concetración inhibitoria mínima puede ser leída directamente. Este es el método de elección para hacer estudios de susceptibilidad en gérmenes problemáticos o con requerimientos especiales, como por ejemplo Streptococcus pnemoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y gérmenes anaeróbicos.

Métodos automatizados:
En este momento existen varios sistemas que ofrecen diferentes niveles de automatización para el estudio de susceptibilidad. Utilizan una medición turbidimétrica o fluorométrica para detectar crecimiento bacteriano en un medio líquido. La mayoría de ellos emplea el método de microdilución y períodos de incubación menores que los habituales. Estos métodos son bastante confiables para el estudio de enterobacterias y otros gérmenes de crecimiento rápido, pero generalmente no son los adecuados para los de crecimiento lento o con requerimientos especiales.

Interpretación del antibiograma

Definiciones

– Susceptible: significa que la infección causada por ese organismo puede ser apropiadamente tratada con las dosis habituales del antibiótico estudiado.

– Sensibilidad intermedia: esta categoría incluye organismos que son inhibidos por concentraciones del antibiótico que están muy cercanas a las alcanzadas en el plasma, por lo que pueden responder pobremente a la terapia. Esta categoría, además, implica que ese antibiótico puede ser usadsi la infección está localizada en sitios donde el fármaco es fisiológicamente concentrado (por ejemplo las quinolonas en vías urinarias), o cuando pueden ser usadas altas dosis (ejemplo penicilina)….

– Resistente: significa que el organismo no sería inhibido por el antibiótico en las dosis habituales o que el organismo tiene mecanismos de resistencia contra ese determinado antibiótico.

Puntos de corte

El punto de corte se refiere a la CIM (si se ha usado un método de dilución) o el diámetro de inhibición (si se ha usado difusión por disco) con los cuales un organismo puede ser clasificado como S, I o R. Estos puntos han sido determinados de acuerdo a estudios microbiológicos que incluyen información sobre la distribución de los diámetros de inhibición a las CIM para un determinado antibiótico en variadas poblaciones bacterianas. El factor más importante para definir las categorías es la concentración que alcanza un antibiótico en el plasma.Obviamente, un organismo no puede ser definido como susceptible si las concentraciones que se necesitan para inhibir este organismo son mayores que aquellas que alcanzadas en el suero.

Ejemplos de interpretación de concentración inhibitoria mínima

* Cepas aisladas de orina pueden ser consideradas susceptibles ya que el antibiótico es concentrado en orina en niveles sobre la CIM
** La dosis puede ser aumentada o se puede cambiar la vía de administración para obtener niveles de antibiótico que sobrepasen la CIM
 *** En meninges inflamadas
FIN TABLA

Cuando el laboratorio informa que un organismo es susceptible, se debe a que se ha hecho una interpretación basada en las concentraciones que el antibiótico correspondiente alcanza en el suero. Como regla general la concentración alcanzada en el plasma (y en el sitio de infección)debe ser por lo menos 2 a 4 veces más alta que la concentración inhibitoria mínima para que el antibiótico sea efectivo clínicamente.

En la próxima tabla se muestra un ejemplo del informe habitual de un antibiograma realizado en el Laboratorio de Microbiología del Hospital Clínico de la Universidad Católica. El método utilizado es dilución en agar y los resultados son expresados como S, I, R. Además se informa la CIM en ug/ml a varios agentes antimicrobianos. En este ejemplo, el S.aureus es resistente a penicilina (R8) ya que la concentración mínima necesaria para inhibirlo es 8 ug/ml, lo cual está por encima del punto de corte para ser considerado susceptible (S<0.12 ug/ml). Este mismo S.aureus es susceptible a cefazolina (S1), lo cual significa que se necesita 1 ug/ml de cefazolina para inhibirlo y eso se considera susceptible (S≤8 ug/ml). El resto de los antibióticos son informados de acuerdo a sus propios puntos de corte. No todos los antibióticos analizados son informados, ya que si una cepa es susceptible a los antibióticos más comúnmente usados en este tipo de infecciones, el resto no se informa.

Informe de un antibiograma

Además, existen casos en los cuales sabemos que no existe una buena correlación entre los resultados in vitro y la eficacia clínica. Por ejemplo, los S.aureus. resistentes a meticilina deben ser considerados resistentes a todos los agentes beta- lactámicos a pesar que pueden aparecer susceptibles por los métodos in vitro.