| Métodos de biología molecular relacionados con ADN y ARNm y sus aplicaciones en traumatología | ||
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| Concepto | Características | Aplicaciones en traumatología |
| Citogenética molecular | – Técnicas de biología molecular que permiten el análisis de una ADN específico de una célula. – Estas técnicas incluyen la hibridación fluorescente in situ (Fluorescent In Situ Hybridization -FISH-) y la hibridación genómica comparada (Comparative Genomic Hybridization -CGH-). |
– Estas técnicas se utilizan para la detección de tumores óseos, estudio genético de deformidades anatómicas e investigación en ciencias básicas. |
| Hibridación in situ (ISH -In Situ Hybridization- y FISH -Fluorescent In Situ Hybridization-) |
– Técnica que permite localizar una secuencia de ácidos nucleicos en una células o tejido a partir de una hebra corta de ADN o ARN (sonda o probe) que es complementaria a la secuencia que se busca detectar. – La técnica de FISH es una hibridación in situ con una sustancia fluorescente únida químicamente a la sonda, permitiendo la identificación de la secuencia de ADN o ARN bajo microscopía fluorescente. |
– FISH es utilizado para detectar oncogenes (ARNm) o genes mutados en especímenes patológicos. |
| Citometría de flujo | – Técnica utilizada para clasificar, analizar y contar componentes biológicos, usualmente células, a través del paso de ellas por un dispositivo de detección. | – Se utiliza para detectar tumores óseos. – Por ejemplo, las células del sarcoma de Ewing son detectadas a través de la citometría de flujo (células con antígeno CD99 + y CD45 -). |
| Ensayo de gen reportero (Reporter gene assay) |
– Método que utiliza un marcador genético específico para estudiar la expresión y localización de otros genes vecinos o asociados. – Ejemplo de gen reportero: LacZ, gen que codifica la enzima β-galactosidasa |
– Evalúan la expresión de un gen específico en una célula o tejido. – Por ejemplo, el gen BGLAP, el cual codifica para la osteocalcina, es un gen reportero que se utiliza para identificar anabolismo o formación ósea. |
| Reacción de polimerasa en cadena (PCR -Polymerase Chain Reaction-) |
– Método de replicación o amplificación de una región específica del ADN de una célula, para lograr una concentración que pueda ser detectada por otros métodos analíticos. – La amplificación requiere esencialmente de un partidor (primer) que contiene los nucléotidos complementarios para el inicio de la replicación de una región del ADN y de una polimerasa de ADN que permite la reacción en cadena. |
– Se utiliza en múltiples áreas, incluyendo el diagnóstico de infecciones a través de ADN del patógeno cuando el cultivo no es lo suficientemente sensible y/o específico (por ejemplo en VIH). |
| PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR -Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction-) |
– Técnica que permite generar ADN a partir de una plantilla de ARN a través del proceso de transcripción reversa acoplada a la técnica de PCR. | – Se utiliza en varias técnicas de laboratorio, dentro de las cuales se encuentran la clonación molecular, secuenciación de ARN y análisis del genoma. |
| Northern blot | – Técnica utilizada para identificar y cuantificar moléculas específicas de ARN. – Las moléculas de ARN son separadas a través de una electroforesis en gel para luego ser estudiadas. – Esta electroforesis permite la separación de las moléculas de ARN en un gel según el tamaño y carga eléctrica de las moléculas. |
– Permite la detección de la expresión de ARNm en células, tejidos y fluidos, el cual es una forma de expresión genética. – Por ejemplo esta técnica se ha utilizado para evaluar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes supresores tumorales en células cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales. |
| Micro-matriz de ADN complementario o chip de ADN complementario (ADNc microarray) |
– Proceso a través del cual se determina si una célula o especimen de tejido contiene un segmento específico de ADN. – Esto se realiza a través de una micro-matriz o chip de ADN complementario, el cual contiene micro-cantidades de genes, segmentos de ADN o ARNm que son complementarios al ADN en estudio. – En el caso que los segmentos complementarios se unan, se identifican por la técnica de FISH. |
– Se utiliza para comparar la expresión de genes en células normales y malignas (por ejemplo células que reabsorben hueso en el osteosarcoma). – También se utiliza para evaluar la expresión génica de macrófagos que han sido expuestos a biomateriales, para de esta forma poder determinar la liberación de citoquinas inflamatorias en los desgastes de implantes. |
| Secuenciación de ADN (DNA sequencing) |
– Identificación de las secuencias de nucléotidos de un gen o región del ADN. | – Esta es la base de la genómica. El ADN humano fue completamente secuenciado el año 2000 y corresponde a la información de 20500 genes. |
| Southern blot | – Técnica que permite detectar una secuencia específica de ADN en una muestra de ADN. – La muestra se digiere con la enzima endonucleasa y después se utiliza electroforesis en gel para separar los fragmentos. – Luego se depositan en una membrana de nylon o nitrocelulosa para realizar hibridación in situ. |
– Se utiliza para reconocer genes específicos de especímenes de tejido óseo. |
| Tecnología recombinante | – Abarca una serie de procedimientos utilizados para producir una proteína específica. – Se describen las dos técnicas más comúnmente utilizadas: – Una secuencia de ADN que codifica la proteína es sintetizada e insertada en el ADN de una célula, la cual sintetiza la proteína específica. – El ADN o ARNm de la proteína es sometido a RT-PCR, lo cual sintetiza la proteína in vitro. |
– Esta tecnología ha permitido la síntesis y producción de numerosas proteínas, incluyendo las proteínas morfogenéticas óseas humanas recombinantes (rhBMPs) y el ligando del receptor activador para el factor nuclear κβ (RANKL). – Se utiliza también en estudios funcionales de genes. |
| Manipulación de ADN | – Una serie de procedimientos que involucran la fragmentación enzimática del ADN o ARN, la combinación o inserción de segmentos de ADN o ARN en otros segmentos o la copia de ADN o ARN para la síntesis de proteínas específicas. | – Esta área tiene amplias aplicaciones, incluyendo la terapia génica (corrección de defectos en genes). |
| Fragmentación de ADN (DNA restriction digest) e Inserción de ADN (DNA ligation or pasting) |
– Técnicas que permiten respectivamente fragmentar ADN en localizaciones específicas (a través de las enzimas endonucleasas) e insertar fragmentos de ADN en secuencias más largas (a través de las enzimas ligasas). | – Ampliamente utilizado para remover y/o agregar fragmentos específicos de ADN en técnicas de biología molecular. – Por ejemplo se puede utilizar para insertar fragmentos de ADN en vectores para terapia génica. |
| Transformación genética | – Inserción de un gen u otro fragmento de ADN en el genoma de una célula no animal (bacterias, hongos, plantas), que resulta en modificaciones genéticas de la misma. – Esto puede ocurrir de manera natural o de forma artificial a través de RT-PCR, entre otras técnicas. |
– Amplias aplicaciones en terapia génica y detección de actividad celular. – Por ejemplo un fragmento de gen que produce una proteína bioluminiscente se puede introducir a una células osteogénica para marcarla y evaluar su progreso y actividad celular. |
| Transfección | – Inserción de un gen u otro fragmento de ADN en el genoma de una célula eucariótica animal, que resulta en modificaciones genéticas de la misma. – Se pueden utilizar distintas herramientas, incluyendo plásmidos, virus y permeabilización de la membrana celular a través de electroporación (campos eléctricos) o sustancias químicas (fosfato de calcio). |
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| Terapia génica | – Inserción de genes en el genoma de un individuo, los cuales están ausentes o son no funcionantes. – La terapia génica debe producir un gen funcional y se realiza en las células y tejidos con el objetivo de tratar una enfermedad o realizar marcaje génico (seguimiento de células). |
– La terapia génica se utiliza para enfermedades letales sin tratamiento, en las cuales la causa es un único gen que ya está clonado y la regulación del gen es precisa y conocida. – Hasta la fecha, la mayoría de sus aplicaciones son en el campo del cáncer y utilizando como vectores virus (retrovirus y adenovirus). – Un área de estudio actual en traumatología es la terapia génica en artrosis primaria, la cual se encuentra en etapa experimental y está enfocada en el bloqueo del efecto de la interleuqina 1 (IL-1). |
Etapas de la reacción de polimerasa en cadena (Polymerase chain reaction -PCR-)
«Polymerase chain reaction» by Enzoklop – Own work. Licensed under Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 via Wikimedia Commons – http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Polymerase_chain_reaction.svg#mediaviewer/File:Polymerase_chain_reaction.svg
| Métodos de biología molecular relacionados con proteínas y sus aplicaciones | ||
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| Concepto | Características | Aplicaciones en traumatología |
| Inmunohistoquímica / Inmunocitoquímica | – Método para detectar y localizart una proteína específica en una célula o tejido. – Se requiere del uso de un anticuerpo específico que se une a la proteína en estudio. – Habitualmente el anticuerpo está marcado con fluorescencia u otra sustancia que permite identificarlo cuando está unido a la proteína. |
– Algunas de las proteínas comúnmente estudiadas con esta técnica son los marcadores tumorales y las citoquinas, utilizándose en la detección de tumores músculo-esqueléticos o hematopoiéticos. |
| Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay -ELISA-) |
– Método de detección y cuantificación de proteínas específicas solubles. – En este método una enzima está unida a un anticuerpo que reconoce, el cual se une a la proteína específica. – Al unirse, la enzima genera un producto detectable, como por ejemplo cambio de color, que actúa como marcador de la proteína en estudio a través de cuantificación fotométrica. – También se puede utilizar un segundo anticuerpo que reconoce al primero y permite luego detectar la proteína en estudio. |
– Se utiliza para identificar y cuantificar en fluidos, células y tejidos proteínas como la fosfatasa alcalina y amilasa, entre muchas otras de interés clínico. |
| Ensayo del ácido bicinconínico (Bicinchoninic acid assay – BCA-) |
– Test bioquímico utilizado para determinar la concentración total de una proteína en un fluido. – A través del reactivo ácido bicincónico los enlaces peptídicos forman un producto de color, el cual es cuantificado fotométricamente. |
– Utilizado para determinar la concentración de varias proteínas en fluidos. |
| Ensayo de fosfatasa ácida tartrato-resistente (Tartrate Resistant Acid Phosphatase -TRAP-) |
– Técnica de tinción para identificar la fosfatasa ácida tartrato-resistente (TRAP), la cual es marcador de los osteoclastos. | – Permite identificar y cuantificar los osteoclastos en especímenes de tejido óseo. |
| Electroforesis de proteínas (Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis -SDS-PAGE-) |
– Técnica que separa las proteínas según su peso molecular y carga eléctrica. – Un fluido con proteínas disueltas se aplica en el extremo de un gel y después de aplicar corriente eléctrica se observa su avance según peso molecular y carga. – Para observar las bandas de proteínas se utiliza la tinción con azul de Coomassie. |
– Utilizado para identificar, aislar e investigar una amplia variedad de proteínas. |
| Western blot | – Técnica utilizada para identificar una proteína específica en un extracto de tejido. – Esta técnica requiere de una electroforesis de proteínas (SDS-PAGE), seguida de la transferencia de las proteínas a un gel de poliacrilamida o a una membrana. – Finalmente se aplica un ELISA para identificar la proteína en estudio. |
– Utilizada para investigar la expresión de proteínas específicas en especímenes de tejidos. – Esto permite, por ejemplo, identificar proteínas con alteraciones en su síntesis, así como evaluar mecanismos de función del tejido óseo a través de proteínas. |
| Inmunoprecipitación | – Método de precipitación de una proteína en una solución a través del uso de anticuerpos específicos. | – Utilizado para aislar proteínas involucradas en mecanismos biológicos del tejido óseo. |
| Análisis proteómico comparativo | – Método que utiliza el procesamiento mecanizado con apoyo computacional de secuencias de péptidos para realizar un análisis rápido de todas las proteínas de un tejido en estudio. | – Permite crear un perfil de la actividad de las proteínas en un tejido normal o patológico, lo cual tiene un amplio uso en investigación de medicamentos que afectan la función del tejido óseo. |
Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas o ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
«ELISA diagram» by Cavitri – Own work. Licensed under Creative Commons Attribution 3.0 via Wikimedia Commons – http://commons.wikimedia.org/wiki/File:ELISA_diagram.png#mediaviewer/File:ELISA_diagram.png